Food Wiki

ค้นหา 6,333 คำศัพท์

Direct plating method

Direct plating method วิธีการวางตัวอย่างลงบนผิวของอาหารเลี้ยงเชื้อโดยตรง

 

วิธีนี้เป็นวิธีการที่มีประสิทธิภาพสำหรับอาหารทุกชนิด โดยเฉพาะสำหรับการตรวจหา เพาะเลี้ยงและแยก

เชื้อราจากอาหารที่เป็นชิ้นเล็กๆ ได้แก่ เมล็ดธัญชาติ และเมล็ดถั่ว วิธีนี้จะวางตัวอย่างที่จะวิเคราะห์ลงบนพื้นผิว

ของอาหารเลี้ยงเชื้อโดยตรง ส่วนมากจะชะล้างผิวของตัวอย่างก่อนด้วยสารละลายคลอรีนที่เตรียมใหม่ๆ เพื่อ

ให้สิ่งสกปรกที่ปนเปื้อน เช่น ฝุ่นละออง และสิ่งอื่นๆ หลุดออกไป ขั้นตอนนี้เป็นขั้นตอนที่จำเป็น เพื่อให้เชื้อราที่

เจริญอยู่ภายในตัวอย่างสามารถเจริญขึ้นได้ แต่อาจคงขั้นตอนการชะล้างผิวของตัวอย่างได้ในกรณีที่มีเชื้อรา

ที่ต้องการตรวจสอบเจริญอยู่ที่ผิว และเชื้อรานี้จะเป็นส่วนหนึ่งของเชื้อราที่เข้าไปเจริญอยู่ที่ผิว และเชื้อรานี้เป็น

ส่วนหนึ่งของเชื้อราที่เจริญเข้าไปในอาหาร เช่น เมล็ดข้าวสาลีที่จะนำไปใช้ในการผลิตแป้งข้าวสาลี ผลจากการ

วิเคราะห์ด้วยวิธีนี้จะแสดงเป็นร้อยละของการปนเปื้อนด้วยเชื้อราในตัวอย่าง ในการตรวจสอบเชื้อราแต่ละชนิด

ในอาหารรวมถึงเชื้อราที่สร้างสารพิษ วิธีการวางตัวอย่างโดยตรงจะมีประสิทธิภาพมากกว่าวิธีการเจือตาง

ตัวอย่าง แต่จะมีประสิทธิภาพในการตรวจหายีสต์

 

อุปกรณ์

1. ตัวอย่างอาหารชนิดต่างๆ ได้แก่ เมล็ดถั่ว เมล็ดธัญชาติชนิดต่างๆ ผลไม้แห้ง ผลไม้แช่อิ่ม น้ำผลไม้ และอาหารที่มีการเจริญของเชื้อรา

2. เชื้อราที่ทำให้อาหารเสีย ได้แก่ Rhizopus stolonifer, Aspergillus flavus, Aspergillus ochraceus,

Fusarium moniliforme

3. ยีสต์ที่ทำให้อาหารเสีย ได้แก่ Candida lipolytica, Hanseniaspora uvarum, Rhodotorula glutinis,

Pichia membranaefaciens, Schizosaccharomyces pombe และ Zygosaccharomyces rouxii

4. อาหารเลี้ยงเชื้อ ได้แก่

- Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar (DRBC) เป็นอาหารเลี้ยงเชื้อชนิดที่เหมาะสมสำหรั

เชื้อราและยีสต์ จากตัวอย่างอาหารสดหรืออาหารที่มีค่า aw สูง อาหารเลี้ยงเชื้อที่มีโรสเบนกอล (Rose

Bengal) จะไวต่อแสง เนื่องจากสารยับยั้งจะเกิดขึ้นถ้าหากได้รับแสง เป็นเวลา 2 ชั่วโมง ดังนั้น เมื่อเตรียมเสร็จแล้ว

ควรเก็บอาหารเลี้ยงเชื้อนี้ไว้ในที่มืด

- Dichloran 18% Glyceral Agar (DG18, aw 0.955) ใช้เลี้ยงเชื้อราจากอาหารที่มีค่า aw ต่ำกว่า 0.95 ได้แก่

ฟังไจที่ชอบสภาพแห้ง (Xerophilic fungi) เช่น Aspergillus, Penicilium หลายชนิดและ Xeromyces

bisporus จากอาหารที่มีค่า aw ต่ำหรืออาหารแห้ง เช่น เมล็ดธัญชาติ ถั่ว แป้ง เครื่องเทศและอื่นๆ DG18 ไม่

เหมาะสำหรับตรวจหาเชื้อราในผักและผลไม้

- Rose Bengal Chloramphenicol Agar (RBC) ใช้ในกรณีที่ไม่มีปัญหาจากเชื้อราที่เจริญอย่าง

รวดเร็วหมายเหตุ การเดิมสารปฏิชิวนะและสารละลายกรดลงในอาหารเลี้ยงเชื้อ มีจุดประสงค์เพื่อยับยั้ง

การเจริญของแบคทีเรีย คลอแรมฟินิคอลไม่ถูกทำลายด้วยความร้อนในขณะฆ่าเชื้อ การเตรียม

สารละลาย (stock solution) ของคลอแรมฟินิคอล ทำได้โดยชั่งคลอแรมฟินิคอล 0.1 กรัม ใส่ในน้ำกลั่น 40

มิลลิลิตร และเติมสารละลายนี้ (40 มิลลิลิตร) ลงในอาหารเลี้ยงเชื้อทั้งหมด 960 มิลลิลิตรก่อนนำไปฆ่าเชื้อ

(บรรจุ stock solotion ไว้ในขวดสีชา เก็บรักษาไว้ได้ 1 เดือนในตู้เย็น)

5. สารละลายเอทานอล ความเข้มข้นร้อยละ 95 และสารละลายคลอรีน ความเข้มข้นร้อยละ 0.4

6. สารละลายสำหรับเตรียมสไลด์ ได้แก่ สารละลายกรดแล็กทิกผสมคอตตอนบลู (cotton blue) หรือแอนิลีนบลู

(aniline blue) และของเหลวเชียร์สำหรับเติมลงบนสไลด์ (shear's mounting fluid)

7. จานเพาะเชื้อ หลอดทดลอง ปิเปตต์ขนาด 1 มิลลิลิตร ปากคีบ และแท่งแก้วงอ

8. แผ่นสไลด์ (glass slides) กระจกปิดสไลด์ (coverslips)

9. ห่วงเขี่ยเชื้อ (loop) เข็มเขี่ยเชื้อ (needle) และพาสเตอร์ปิเปตต์ที่ปราศจากเชื้อ (sterile Pasteur pipette)

10. ถุงพลาสติกปราศจากเชื้อ (stomacher bag) สำหรับใช้ตีป่นด้วยเครื่อง stomacher

11. เครื่องตีป่นอาหาร (stomacher) ตู้บ่มเชื้อที่อุณหภูมิ 25 องศาเซลเซียส และเครื่องวัด aw (water activity meter)

12. กล้องจุลทรรศน์พื้นหลังสว่าง (bright-field microscope) และกล้องสเตอริโอ (stereomicroscope)

 

วิธีทดลอง

ในการทดลองวิธีนี้สามารถทำได้ใน 2 กรณี ดังนี้

ก) กรณีที่ไม่ชะล้างผิวของตัวอย่างอาหาร

1. ทำการวัดค่า aw ของตัวอย่างที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส ด้วยเครื่องวัด aw

2. นำตัวอย่างอาหารไปแช่แข็งที่อุณหภูมิ -20 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 72 ชั่วโมง เพื่อทำลายแมลงที่ติดมากับ

ตัวอย่างซึ่งอาจขัดขวางการวิเคราะห์

3. ชั่งตัวอย่างอาหาร 50 กรัมใส่บีกเกอร์ปลอดเชื้อ ทำให้ปากคีบปลอดเชื้อ โดยจุ่มในสารละลายเอทานอล

ความเข้มข้นร้อยละ 70 นำมาลนไฟ (ควรเตรียมไว้ใช้หลายๆ อันเพื่อป้องกันไม่ให้ร้อนจนเกินไปจากการลนไฟ

หลายครั้ง) ใช้ปากคีบนี้คีบตัวอย่างอาหารวางบนผิวของอาหารเลี้ยงเชื้อ (ควรใช้ DRBC หรือ RBC สำหรับ

ตัวอย่างอาหารที่มีค่า aw สูง แต่ถ้าตัวอย่างอาหารที่มีค่า aw ต่ำกว่า 0.95 ควรใช้อาหารเลี้ยงเชื้อที่ลดค่า aw

เช่น DG 18) โดยวางตัวอย่าง 5-10 ต่อหนึ่งจาน วางตัวอย่างให้ครบ 50 ชิ้น

4. ซ้อนจานเพาะเลี้ยง 3-5 จาน บ่มที่อุณหภูมิ 25 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 5 วัน ถ้าไม่พบการเจริญบ่มต่ออีก 2 วัน

5. คำนวณการเจริญของเชื้อราเป็นร้อยละ เช่น ถ้ามีเชื้อราขึ้นบนตัวอย่างทั้ง 50 ชิ้น ให้รายงานผลการ

เกิดเชื้อรา ให้รายงานผลเกิดเชื้อรา ร้อยละ 100 ถ้ามีเชื้อราเจริญบนตัวอย่าง 32 ชิ้น รายงานผลเป็นร้อยละ

64 ผู้ที่มีประสบการณ์มากอาจคำนวณหาปริมาณของเชื้อราในแต่ละตระกูลได้จากการส่องกล้องจุลทรรศน์

กำลังขยายต่ำ (10X)

ข) กรณีที่ต้องทำการชะล้างผิวของตัวอย่างอาหาร

1. เตรียมสารละลายคลอรีนความเข้มข้นร้อยละ 0.4 สวมถุงมือยาง ถ้าหากต้องสัมผัสสาร

2. ชั่งตัวอย่าง 50 กรัม ใส่ลงในบีกเกอร์ปลอดเชื้อขนาด 300 มิลลิลิตร เติมสารละลายคลอรีนความเข้มข้นร้อยละ 0.4 ลงไปจนท่วมตัวอย่าง แล้วเขย่าอย่างแรง เป็นเวลา 2 นาที ถ่ายสารละลายคลอรีนออก แล้วชะล้างด้วยน้ำกลั่นปราศจากเชื้อ 2 ครั้ง ครั้งละ 1 นาที

3. ทำการทดลองขั้นต่อไปเหมือนกรณีตัวอย่างที่ไม่ชะล้างผิวทุกประการ ตั้งแต่การวางตัวอย่างลงบนผิวหน้า

อาหารเลี้ยงเชื้อ การบ่มและอ่านผล เปรียบเทียบผลการทดลองทั้ง 2 วิธี เพื่อที่จะตัดสินว่าการเกิดของเชื้อรามาจากผิวของตัวอย่างหรือภายในตัวอย่าง
สังเกตการเจริญของเชื้อรา

4. เขี่ยโคโลนีของเชื้อรานำมาเลี้ยงบนอาหาร PDA หรืออาหารชนิดอื่นๆ เพื่อศึกษาขั้นต่อไป

 

 



(เข้าชม 1,183 ครั้ง)

comments powered by Disqus
สมัครสมาชิก