โครงการพัฒนาการผลิตชาสมุนไพรคุณภาพสูงระดับ SME
"Rapid Method in Aerobic plate count Food Testing"
โดย คุณดาว และเพื่อนๆ
คุณดาว และเพื่อนๆ ในกลุ่มวิจัย การผลิตชาสมุนไพรคุณภาพสูง ได้มีโอกาสฟังการบรรยายจากทีมงาน Sr.Product Speciallist บริษัท 3เอ็ม ประเทศไทย จำกัด ในหัวข้อ วิธีการตรวจเชื้อจุลชีววิทยาทางอาหารด้วยวิธีการตรวจสอบที่รวดเร็ว (rapid method) โดยการใช้ แผ่น 3M PetrifilmTM Plates เพื่อตรวจหาปริมาณ Aerobic plate countรวมทั้งColiform และ Eschericia coliซึ่งคุณดาวจะขออนุญาติเล่าให้ฟัง เพื่อแชร์ความรู้และประสพการณ์ค่ะ
ความสำคัญของการตรวจวิเคราะห์จุลินทรีย์ในอาหาร
เชื้อจุลินทรีย์ที่มีความสำคัญในอาหาร ซึ่งพวกเราชาววิศวกรรมอาหารก็คงจะคุ้นเคยกันเป็นอย่างดี ซึ่งจุลินทรีย์ที่มีความสำคัญด้านอาหร ได้แก่ รา ยีสต์ และแบคทีเรีย พบได้ทั่วไปจากสิ่งแวดล้อม ในดิน อากาศ น้ำ และพบมีการปนเปื้อนได้ในวัตถุดิบพืชสมุนไพร ที่เราจะใช้เพื่อการผลิตชาสมุนไพรในโครงการนี้ คือ ดอกอัญชัน ตะไคร้ ใบเตย และขมิ้น
ปริมาณจุลินทรีย์ในผลิตภัณฑ์อาหาร บ่งชี้ คุณภาพของวัตถุดิบ สุขอนามัยในการผลิต สุขลักษณะส่วนบุคคลความสะอาดบริเวณสถานที่ประกอบการ ส่งผลกระทบต่อ คุณภาพผลิตภัณฑ์อาหาร อายุการเก็บรักษาและที่สำคัญคือความเสี่ยงต่อการพบเชื้อก่อโรค (Pathogen) ซึ่งจัดเป็นเป็นอันตรายทางอาหาร (biological hazard) พี่ๆทีมงาน 3 M แนะนำเราให้รู้จักจุลินทรีย์ก่อโรค หลายชนิดที่มีบทบาทสำคัญในอาหาร เช่น Listeria, S.aureus, Salmonella, E.coli (0157) , Vibrio, Shigella, Bacillus, Clostridium , Yersinia เป็นต้น ซึ่งเชื้อก่อโรคเหล่านี้หากร่างกายได้รับเข้าไปก็จะเป็นอันตรายทำให้เกิดโรคอาหารเป็นพิษเช่น ท้องเดิน ปวดท้อง อาเจียร และบางชนิด อาจเป็นอันตรายขั้นร้ายแรงถึงชีวิตได้
การล้างจะเป็นการลดปริมาณจุลินทรีย์ปนเปื้อน ซึ่งมีทั้งแบคทีเรียและสปอร์ของแบคทีเรีย (bacterial spore) ที่เป็นสาเหตุของการเสื่อมเสีย (microbial spoilage) เชื้อที่ใช้เป็นดัชนีชี้วัดในเรื่องของคุณภาพอาหาร (Indicator microorganisms) ซึ่งได้แก่ แบคทีเรียในวงศ์ Enterobacteriaceae กลุ่ม Coliform, E.coli, , Streptococcus feacalis ช่วยลดปริมาณจุลินทรีย์ก่อโรค มาถึงในเรื่องของการตรวจสอบคุณภาพทางจุลชีววิทยา โดยจะแบ่งเป็นการตรวจเชิงคุณภาพ (3M TecraTM VIA) ที่ใช้ในการตรวจหาว่ามีหรือไม่มีเชื้อนั้น ๆ ปนเปื้อนอยู่ในอาหาร ซึ่งมักใช้ตรวจ
หาเชื้อก่อโรค และในส่วนของการตรวจเชิงปริมาณ (3M PetrifilmTM Plate) จะเป็นการตรวจหาจำนวนเชื้อที่ปนเปื้อนอยู่ในอาหาร ที่มักใช้ตรวจหาเชื้อดัชนีคุณภาพอาหาร โดยจะมีการรายงานผลของเชื้อเป็นจำนวนที่นับได้ทั้งหมด มีหน่วยเป็น CFU/ml หรือ CFU/g ......หรือกล่าวง่าย ๆ ว่า เชิงคุณภาพ ก็จะบอกว่า มีหรือไม่มี เชื้อนั้นอยู่ แต่ถ้าเป็นเชิงปริมาณแล้วล่ะก็ต้องเน้น ๆ แบบว่าให้เห็นตัวเลขกันชัด ๆ ไปเลยค่ะว่า ที่มีน่ะมีเท่าไร โดยชนิดของแผ่นเพาะเลี้ยงเชื้อ 3M PetrifilmTM นั้นก็มีหลายชนิด ได้แก่ Aerobic Count Plate / Yeast & Mold Count Plate / Coliform Count Plate / Rapid Coliform Count Plate / High Sensitivity Coliform Count Plate / E.coli/Coliform Count Plate / Enterobacteriaceae Count Plate / Staph Express Count Plate / Environmental Listeria Count Plate
ทำไมต้องตรวจสอบคุณภาพทางจุลชีววิทยา
การตรวจสอบทุกสิ่งทุกอย่างก็เพื่อความปลอดภัยในทุก ๆ ด้าน นั่นแหละค่ะ สิ่งสำคัญของการตรวจสอบคุณภาพทางจุลชีววิทยา พวกพี่ ๆ 3M เขาบอกว่าก็เพื่อให้แน่ใจว่าผลิตภัณฑ์มีความปลอดภัย และสามารถเก็บรักษาได้ในสภาวะและช่วงเวลาที่กำหนด (Shelf-life) รวมถึงเพื่อให้แน่ใจว่าวัตถุดิบ ส่วนประกอบในอาหาร และผลิตภัณฑ์สุดท้ายนั้น มีจำนวนจุลินทรีย์อยู่ในช่วงที่กำหนด (microbiological criteria) และก็เพื่อทวนสอบ (verification) และรับรอง (validation) แนวปฏิบัติและวิธีการที่ใช้ในการควบคุมกระบวนการผลิตในขั้นตอนต่าง ๆ ว่ายังอยู่ภายใต้การควบคุมตามข้อกำหนดนั้น ๆ โดยเฉพาะในการทวนสอบ รับรอง เฝ้าระวังและการควบคุมจุดวิกฤติ รวมถึงวิธีการแก้ไขด้วยเช่นเดียวกัน
ประวัติความเป็นมา
เจ้าแผ่นนี่ก็ได้ถูกคิดค้นขึ้นโดยนักวิทยาศาสตร์ที่ได้บังเอิญเห็นตัวเทปกาวชนิดใสแล้วก็เกิดเป็นไอเดียในการต่อยอดพัฒนาเป็นแผ่นตรวจเชื้อ 3M PetrifilmTM Plates นี่แหละค่ะ
ส่วนประกอบและคุณลักษณะ
เอาล่ะค่ะเรามาทราบกันดีกว่าว่า 3M PetrifilmTM Plates เนี่ยมันคืออะไรกันนะ พี่ 3M เขาบอกว่า Petrifilm มันเป็นอาหารเลี้ยงเชื้อสำเร็จรูป โดยมีลักษณะเป็นผงแห้งที่เคลือบอยู่บนแผ่นฟิล์มพลาสติก สำหรับใช้วิเคราะห์หาจำนวนของเชื้อแบคที่เรียและเชื้อยีสต์รา ในส่วนของส่วนประกอบหลัก ๆ ของ 3M PetrifilmTM ก็จะประกอบด้วยแผ่นพลาสติกสองแผ่นที่ประกบกันอยู่ โดยแผ่นบนเป็นแผ่นฟิล์มพลาสติกใสที่แบ่งย่อยออกเป็นอีกสามชั้นที่เคลือบอยู่ ดังนี้ ชั้นบนสุดเป็นแผ่นฟิล์มพลาสติก รองลงมา จะเป็นชั้นของ กาว+สารบ่งชี้ และชั้นล่างจะเป็นเจลละลายในน้ำเย็น ในส่วนของแผ่นล่างนั้นก็จะประกอบด้วยชั้นย่อย ๆ อีกสามชั้นเช่นกัน ชั้นบนสุดเป็นชั้นของอาหารเลี้ยงเชื้อ (Agar) รองลงมาเป็นชั้นของกาว และชั้นล่างสุดของแผ่นล่างจะเป็นแผ่นพลาสติกพิมพ์ลาย ....เห็นแผ่นบางแค่นี้เองแต่ส่วนประกอบนี่เยอะมากเลยที่เดียว (ดูภาพอธิบายด้านล่างนะคะ)
3M PetrifilmTM Aerobic Count Plate (PAC) โดยส่วนประกอบของแผ่นตรวจนั้นตัวสารบ่งชี้ที่ใช้ในแผ่นตรวจชนิดนี้จะเป็น สีไตรเฟนนิล เตทตระโซเลียม คลอไรด์ (Triphenyl Tetrazolium Chloride-TTC) และในส่วนของอาหารเลี้ยงเชื้อนั้นจะเป็น Plate Count Agar ที่แบคทีเรียทั่วไปสามารถเจริญเติบโตได้ดี โดยมีสารที่ทำให้อาหารเลี้ยงเชื้อแข็งตัวคือ เจลที่ละลายในน้ำเย็น
ข้อแตกต่างจากวิธีการทดสอบแบบดั้งเดิม
เอ๊...แล้ว 3M PetrifilmTM เนี่ย แตกต่างกับวิธีทดสอบแบบดั้งเดิม และทำให้ทดสอบได้ง่ายขึ้นยังไงกันนะ เรามาดูกันในส่วนของวิธีการแบบดั้งเดิมกันก่อนเลยค่ะ โดยวิธีการแบบดั้งเดิมนั้นต้องมีการเตรียมอาหารเลี้ยงเชื้อกันอย่างมากมายหลายขั้นตอน เริ่มจากการชั่ง จากนั้นนำไปผสมน้ำ วัดค่า pH ทำออโต้เคท ที่ความดัน 15 lb จากนั้นก็ต้องมีการอบฆ่าเชื้อที่อุปกรณ์ ด้วย Hot air อุณหภูมิ 180 นาน 2-3 ชั่วโมง จานเพาะเลี้ยงเชื้อหรืออุปกรณ์ต่างๆ ก็ต้องมีการมาล้างทำความสะอาด เมื่อทดลองมาก ๆ อุปกรณ์เหล่านี้ก็ต้องมากเช่นเดียวกัน ทั้งเสียเวลาและเปลืองพื้นที่ในการเก็บ เห็นมั๊ยล่ะคะว่าขั้นตอนเยอะมาก ๆ แล้วแผ่น 3M PetrifilmTM นี้ล่ะมันดียังไงกัน พวกพี่ ๆ 3M ก็ได้บอกว่า 3M PetrifilmTM Plates เนี่ยจะช่วยเพิ่มประสิทธิภาพในการทำงาน ทำให้ได้ผลการตรวจสอบที่มีความแม่นยำ เป็นวิธีการที่รวดเร็ว ซึ่งก็จะส่งผลต่อการลดค่าใช้จ่ายโดยรวมได้ด้วย ประหยัดทั้งเงิน ประหยัดทั้งเวลา....แหม มันน่าใช้ซะจริงเชียว !!!
มาตรฐานของการตรวจสอบ
มาถึงในส่วนของวิธีมาตรฐาน (Standard Method) ก็ได้มีการบอกถึงมาตรฐานต่างที่เราสามารถใช้อ้างอิงได้ในการตรวจสอบ อันได้แก่ International Standards : ISO National Standards : TIS, BS, DIN, EPA, BAM Internationally recognized organizations : AOAC, ICUMSA, IOB, IP, ICMSF Nationally recognized organizations : EPA, USFDA, BAM, APHA ว้าว...เยอะแยะมากมายหลายหน่วยงาน แต่ที่พวกพี่ ๆ ได้นำมาเสนอก็จะเป็นหน่วยงานของ AOAC ซึ่ง AOAC = Association of Official Agricultural Chemist เป็นหน่วยงานพิสูจน์ความถูกต้องของวิธีทดสอบ โดยก่อตั้งขึ้นที่ประเทศสหรัฐอเมริกา แต่ได้เป็นที่ยอมรับทั่วโลก ทั้งอเมริกา แถบยุโรป และเอเชีย เลยทีเดียว การพิสูจน์ความถูกต้องของวิธีทดสอบ (Validation) โดยมีกระบวนการตรวจสอบเพื่อพิสูจน์ว่าวิธีทดสอบมีความถูกต้อง น่าเชื่อถือ และเหมาะสมกับวัตถุประสงค์ ได้แก่ ให้เป็นไปตามข้อกำหนดของประเทศหรือระหว่างประเทศ (regulation) การควบคุณคุณภาพสินค้านำเข้าและส่งออก (import/export control) การขอรับรองคุณภาพห้องปฏิบัติการ (in accredited laboratories) เป็นต้น
ขั้นตอนการทดสอบ
การทดสอบปริมาณจุลินทรีย์ในอาหาร
ขั้นตอนของการทดสอบ พี่ ๆ ก็ได้บอกให้พวกเราได้ตั้งใจฟังกันให้ดี เริ่มจากในส่วนของการเจือจางตัวอย่างอาหาร สามารถทำได้โดย ขั้นแรกชั่งตัวอย่างอาหารหนัก 50 กรัมใส่ถุงพลาสติก จากนั้นเติมบัพเฟอร์ ปราศจากเชื้อ (Buffered Peptone Water, Butterfield's phosphate- Buffered) 450 ml ลงไป
นำไปตีบดโดยใช้ Stomacher หรือ Blender เป็นเวลา 2 นาที เราก็จะได้ตัวอย่างอาหารที่เจือจางในอัตราส่วน 1:10เอ๊...แล้วเชื้อในผลิตภัณฑ์มีการกระจายตัวแบบไหน คำตอบก็คือการกระจายตัวของจุลินทรีย์ดังภาพ B โดยเชื้อมักจะมีการกระจายเป็นกลุ่มก้อน ส่วนในภาพ A นั้นจะเป็นการกระจายตัวของสาร
มาต่อกันในเรื่องของการเจือจางตัวอย่างอาหาร โดยวิธีการคือ เราจะดูดตัวอย่างที่ความเจือจาง 1:10 ปริมาตร 1 ml ผสมกับ บัพเฟอร์ 9 ml จะได้ตัวอย่างที่มีความเจือจาง 1:100 เรียกว่า Ten-fold dilution แล้วเราก็จะทำการเจือจางต่อไปจนกว่าจะถึงความเข้มข้นที่ต้องการ การเจือจางตัวอย่างนั้นเราทำเพื่อลดความหนาแน่นของจุลินทรีย์ให้อยู่ในระดับที่ให้ผลการวิเคราะห์ที่เชื่อถือได้ โดยทั่วไปมักทำให้ตัวอย่างเจือจางลงครั้งละ 10 เท่า
ค่ะในส่วนของขั้นตอนต่อไปนี้เราจะมาดูวิธีการสาธิตการทดสอบการใช้แผ่นเพาะเลี้ยงเชื้อ 3M PetrifilmTM อย่างมีประสิทธิภาพกันนะคะ ก็จะเริ่มจาก วางแผ่น Petrifilm บนระนาบเรียบ หยดตัวอย่าง 1 ml ลงบนแผ่นอาหารเลี้ยงเชื้อด้านล่าง จากนั้นค่อย ๆ ปล่อยแผ่นฟิล์มด้านบนลงมา ขั้นตอนนี้ต้องระวังอย่าให้เกิดฟองอากาศ วางตัวกดพลาสติก (Spreader) บนแผ่นฟิล์มด้านบนแล้วออกแรงกด รอให้เจลแข็งตัวประมาณ 1นาที ก่อนทำการเคลื่อนย้ายแผ่น จากนั้นนำแผ่นไปบ่มที่อุณหภูมิ และระยะเวลาตามที่กำหนด
จากนั้นนำไปบ่มเชื้อที่อุณหภูมิ 35ซเป็นเวลา 48 3 ชั่วโมง ในตู้บ่ม (incubator) โดยการวางแผ่นตรวจในเครื่องบ่มเชื้อนั้น สามารถวางซ้อนกันได้ไม่เกิน 20 แผ่น และก็นำมาอ่านผลเมื่อครบเวลา ในการอ่านผล Aerobic Bacteria จะทำการนับโคโลนีที่มีสีแดงทั้งหมดที่อยู่ในพื้นที่วงกลม 20 ตารางเชนติเมตร
การทดสอบปริมาณจุลินทรีย์ในอากาศ
ในส่วนของการทดสอบสิ่งแวดล้อมมาดูการตรวจอากาศ (Air test) กันก่อนเลยค่ะ ขั้นแรกก็หยดบัพเฟอร์ที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้วปริมาตร 1 ml ลงบนแผ่น Petrifilm แล้ววางทิ้งไว้ที่อุณหภูมิห้อง 1 ชั่วโมง เปิดแผ่นฟิล์มด้านบนทิ้งไว้บริเวณที่ต้องการทดสอบนาน 15 นาที จากนั้นนำไปบ่มตามอุณหภูมิและระยะเวลาตามแต่ชนิดของ Petrifilm โดยสามารถเก็บแผ่นที่เตรียมแล้วได้นานถึง 7 วัน ส่วนการทดสอบพื้นผิวโดยตรง (direct contact) สามารถทำได้โดยหยดบัพเฟอร์ที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้วปริมาตร 1 ml ลงบนแผ่น Petrifilm วางทิ้งไว้ที่อุณหภูมิห้อง 1 ชั่วโมง เปิดแผ่นฟิล์มด้านบน จากนั้นนำแผ่นฟิล์มด้านบนไปแปะลงบนพื้นผิวที่ต้องการทดสอบ แล้วใช้นิ้วลูบบนแผ่นฟิล์มด้านหลังเบา ๆเพื่อให้เนื้อเจลสัมผัสกับพื้นผิวอย่างทั่วถึง ทำการปิดแผ่นฟิล์มด้านบนลง ให้ประกบกันดังเดิม จากนั้นนำไปบ่มตามอุณหภูมิและระยะเวลา ตามแต่ชนิดของ Petrifilm ค่ะ
การตรวจนับและรายงานผล3M PetrifilmTM Aerobic Count Plate (PAC) พื้นที่วงกลม 20 ตารางเชนติเมตร โดยสเกล 1 ช่องนั้นจะเท่ากับ 1 ตารางเซนติเมตร จะนับที่โคโลนีมีสีแดง ซึ่งช่วงที่เหมาะสมในการนับโคโลนีจะอยู่ในช่วง 30-300 โคโลนีต่อแผ่น
เราสามารถที่จะใช้การอ่านข้อมูลแบบประมาณได้หากว่าเชื่อที่เกิดขึ้นนั้นมีปริมาณมาก โดยการนับจำนวนจุลินทรีย์ในช่องที่มีการกระจายตัวของเชื้อดีที่สุด จากนั้นก็นำค่าที่นับได้ใน 1 ช่องคูณกับ 20 ก็จะได้ค่าประมาณของเชื้อทั้งหมดค่ะ
สุดท้ายนี้พวกเราก็ขอบอบคุณพี่ ๆ 3M นะคะที่มาให้ความรู้ใหม่ ๆ ในเรื่องของการตรวจเชื้อ ขอบคุณอาจารย์ส้มที่คอยเสริมเพิ่มเติมความรู้ต่าง ๆ ที่นอกเหนือจากนี้ และขอบคุณเพื่อน ๆ โปรเจคทุก ๆ คนที่ต่างก็ตั้งใจฟังกันเป็นอย่างดี ขอบคุณมากค่ะ