Dilution plating method วิธีการเจือจางตัวอย่าง

วิธีนี้เป็นวิธีที่เหมาะสมสำหรับการตรวจนับยีสต์ เนื่องจากยีสต์เป็นสิ่งมีชีวิตเซลล์เดียว หนึ่งโคโลนีจึงเจริญมา

จากหนึ่งเซลล์ และยังใช้ได้ดีกับการแยกเชื้อราจากอาหาร แต่ไม่เหมาะกับการประเมินจำนวนเชื้อรา เนื่องจากเชื้อรา

ประกอบด้วยเส้นใยมากมายและมีการสร้างสปอร์ขึ้นจำนวนมาก จึงทำให้มีจำนวนของสิ่งมีชีวิตเพิ่มมากขึ้น ถึง

แม้ว่าจะมีมวลเซลล์ของเชื้อราเพียงเล็กน้อยก็ตาม เซลล์ของชิ้นส่วนเส้นใย และสปอร์จำนวนมากนี้มีโอกาสจะเจริญ

เป็นโคโลนีมากมายบนผิวของอาหารเลี้ยงเชื้อ

ดังนั้น จำนวนโคโลนีของเชื้อราที่ขึ้นอยู่บนอาหารเลี้ยงเชื้อ จึงขึ้นอยู่กับความมากน้อยในการทำให้อาหารเป็น

เนื้อเดียวกันในขั้นตอนการตีป่นอาหาร เนื่องจากในขณะที่ตีป่นอาหารจะทำให้เส้นใยของเชื้อราแตกหักออก ฉะนั้น

ปริมาณของเชื้อราในอาหารจึงไม่อาจประเมินได้จากจำนวนโคโลนีของเชื้อราที่นับได้บนอาหารเลี้ยงเชื้้อ

 

อุปกรณ์

1. ตัวอย่างอาหารชนิดต่างๆ ได้แก่ เมล็ดถั่ว เมล็ดธัญชาติชนิดต่างๆ ผลไม้แห้ง ผลไม้แช่อิ่ม น้ำผลไม้ และอาหารที่มี

การเจริญของเชื้อรา

2. เชื้อราที่ทำให้อาหารเสีย ได้แก่ Rhizopus stolonifer, Aspergillus flavus, Aspergillus ochraceus, Fusarium moniliforme

3. ยีสต์ที่ทำให้อาหารเสีย ได้แก่ Candida lipolytica, Hanseniaspora uvarum, Rhodotorula glutinis,

Pichia membranaefaciens, Schizosaccharomyces pombe และ Zygosaccharomyces rouxii

4. อาหารเลี้ยงเชื้อที่ใช้ ได้แก่

- Potato Dextrose Agar (Acidified PDA) ที่ปรับค่า pH ให้ได้ประมาณ 3.5 ด้วยกรดทาร์ทาริก เตรียมได้โดยใช้

สารละลายกรดทาร์ทาริกความเข้มข้นร้อยละ 10 ที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้วลงในอาหาร PDA (อุณหภูมิ 45 องศาเซลเซียส) เขย่าให้

เข้ากัน ก่อนจะเทลงในจานเพาะเลี้ยงเชื้อ

- Malt Extract Yeast Extract 50% Glucose Agar (MY 50G, a_w 0.89)

- Malt Extract Yeast Extract 5% Salt 12% Glucose (MY 5-12) Agar และ Malt ExtractYeast Extract 10% Salt 12%

Glucose (MY 10-12) Agar อาหาร MY 5-12 และ MY 10-12 เหมาะสำหรับเพาะเลี้ยงเชื้อรา และยีสต์ที่ชอบสภาพ

แห้งที่เจริญในอาหารเค็ม (halophilic xerophile)

5. สารละลายที่ใช้เจือจางอาหารตัวอย่าง (diluents) ได้แก่ สารละลายเพปโทนความเข้มข้นร้อยละ 0.1 เป็น

สารละลายที่เหมาะสำหรับทำเจือจางตัวย่างที่มีทั้งเชื้อราและยีสต์ หรืออาจใช้สารละลายอื่น เช่น สารละลายแกลือ

ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ หรือน้ำกลั่นก็ได้ การเติมสารที่ช่วยให้เปียก (wetting agent) เช่น พอลิซอร์บิเทน 80 (polysorbitan

80) หรือทวีน 80 (tween 80) อาจเหมาะสำหรับผลิตภัณฑ์บางชนิด ในกรณีที่ตรวจหาจำนวนยีสต์จากอาหารที่มี

น้ำตาลสูง เช่น ผลไม้แห้ง ผลไม้แช่อิ่ม และน้ำผลไม้เข้มข้น ควรเติมน้ำตาลซูโครสหรือกลูโคสหรือกลีเซอรอลร้อย

ละ 20 ลงในสารละลายเพปโทนความเข้มข้นร้อยละ 0.1 เพื่อป้องกันการบาดเจ็บของเซลล์อันเนื่องมาจากการเปลี่ยน

แปลงความดันออสโมสิส (osmotic shock)

 

6. จานเพาะเชื้อ หลอดทดลอง ปิเปตต์ขนาด 1 มิลลิลิตร ปากคีบ และแท่งแก้วงอ

7. ห่วงเขี่ยเชื้อ (loop) เข็มเขี่ยเชื้อ (needle) และพาสเตอร์ปิเปตต์ที่ปราศจากเชื้อ (steriled Pasteur pipette)

8. ถุงพลาสติกปราศจากเชื้อสำหรับใช้ตีป่น (stomacher bag) ด้วยเครื่องตีป่นอาหาร (stomacher)

9. เครื่องตีป่นอาหาร ตู้บ่มเชื้อที่อุณหภูมิ 2 5 องศาเซลเซียส และเครื่องวัด a_w (water acrivity meter)

 

ขั้นตอนการประเมินจำนวนเชื้อราและยีสต์ในอาหารด้วยวิธีการเจือจางตัวอย่าง (Dilution plating method)

1. ทำการวัดค่า a_w ของตัวอย่างอาหาร โดยตัดตัวอย่างเป็นชิ้นเล็กๆ บรรจุใส่ตลับพลาสติกสำหรับวัด ค่า a_w

ประมาณ 2 ใน 3 ของปริมาณตลับ นำไปวัดค่า a_w ที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส ด้วยเครื่องวัด a_w

2. ชั่งตัวอย่างอาหาร 25 กรัม ด้วยเทคนิคปลอดเชื้อ เทใส่ถุงพลาสติกปราศจากเชื้อ แล้วเติมสารละลายเพปโทน

ความเข้มข้นร้อยละ 0.1 ปริมาณ 225 มิลลิลิตร นำไปตีป่นด้วย เครื่องตีป่นอาหารนาน 2 นาที ในกรณีที่เชื้อราอยู่

ภายในเมล็ดธัญชาติหรือถั่วควรแช่ไว้ในสารละลายเพปโทนนาน 30 นาทีที่อุณหภูมิห้องก่อนนำไปตีป่น

3. เจือจางตัวอย่างต่อๆไปจนได้ระดับความเจือจางที่ 10^-2, 10^-3 และ 10^-4 ด้วยสารละลายเพปโทนความเข้มข้น

ร้อยละ 0.15

4. ปิเปตต์ตัวอย่างที่ระดับความเจือจาง 10^-3, 10^-4 และ 10^-5 ปริมาตร 0.1 มิลลิลิตร ลงบนผิวของอาหารสำหรับเพาะ

เลี้ยงเชื้อราและยีสต์ 2 ชนิด ที่มีผิวหน้าแห้ง ได้แก่ Acidified PDA และอาหารเลี้ยงเชื้อที่ลดค่า a_w 1 ชนิด (กลุ่มที่ได้

รับตัวอย่างที่มีน้ำตาลสูงให้ใช้ MY 50 G และกลุ่มที่ได้รับตัวอย่างที่มีเกลือสูงให้ใช้ MY5-12 หรือ MY 10-12) ใช้

แท่งแก้วงอที่ปราศจากเชื้อ เกลี่ยตัวอย่างให้ทั่ว แล้วนำไปบ่มที่อุณหภูมิ 25 องศาเซลเซียส ไม่ต้องคว่ำจาน ไม่ควรซ้อนกัน

มากกว่า 3 จาน เมื่อบ่มจนครบ 5 วัน นับโคโลนีบนจานที่มีจำนวนโคโลนี 10-150 โคโลนี ถ้าไม่มีการเจริญ ให้บ่มต่อ

อีก 2 วัน รายงานผลเป็นค่า CFU ต่อกรัม หรือ CFU ต่อมิลลิลิตร ถ้าไม่มีโคโลนีใดๆขึ้นเลยให้รายงานว่ามีเชื้อรา

และยีสต์น้อยกว่า 1 เท่า ของระดับความเจือจางต่ำสุด เปรียบเทียบจำนวนโคโลนีและสังเกตลักษณะของโคโลนีที่ขึ้น

บนผิวหน้าของอาหารเลี้ยงเชื้อทั้งสองชนิด

5. เขี่ยเชื้อจากโคโลนีที่มีลักษณะแตกต่างกัน 2-3 โคโลนี ที่ขึ้นบนอาหารเลี้ยงเชื้อทั้ง 2 ชนิด นำไปแยกให้บริสุทธิ์

ด้วยเทคนิคการแยกเชื้อบริสุทธิ์ จากนั้น เขี่ยเชื้อมาลากบนผิวหน้าอาหารในหลอด PDA slant บ่มจนกระทั่งเชื้อเจริญ

และเก็บไว้ที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส เพื่อจำแนกชนิดต่อไป