วิธีการตรวจหา Enteropathogenic vibrio ในอาหาร

วัสดุและอุปกรณ์

1. Alkali peptone water pH 8.4-8.5 ทั้งชนิดที่ไม่ใส่และใส่ NaCl 3%

2. อาหารเลี้ยงเชื้อ Thiosulfate citrate bile salt sucrose agar (TCBS) ทั้งชนิดที่ไม่ใส่และใส่ NaCl 3%

3. Ol-polyvalent antiserum

4. ตัวอย่างอาหาร

5. น้ำยาทดสอบ oxidase tetrametyl-p-phenylene diamine หรือ dimethyl-p-phenylene diamine hydrochloride ความเข้มข้น 1%

6. จานเพาะเชื้อ

7. ชุดย้อมสีแกรม

8. ปิเปตที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้ว

 

วิธีปฏิบัติ

1. โดยชั่งตัวอย่าง 25 g. ใส่ถุงพลาสติกปราศจากเชื้อ ตีปั่นให้เป็นเนื้อเดียวกัน ใส่ลงใน alkali peptone water pH 8.4-8.5 ปริมาตร 225 ml. ทั้งชนิดที่ไม่ใส่และใส่ NaCl 3% แล้วบ่มที่อุณหภูมิ 35°C เป็นเวลา 18 ชั่วโมง

2. แล้วนำอาหารไปเจือจางต่อใน alkali peptone water pH 8.4-8.5 ทั้งชนิดที่ไม่ใส่และใส่ NaCl 3% ปริมาตร 9 ml. ทำเช่นเดียวกันนี้จนได้ความเจือจางที่ 10^-2 และ 10^-3

3. ดูดสารละลายตัวอย่าง 10^-2 และ 10^-3 (ทำ 2 ซ้ำ) แต่ละความเจือจางปริมาตร 0.1 ml.ใส่ในจานอาหาร TCBS จากนั้น spread plate ให้ทั่ว บ่มที่อุณหภูมิ 35°C เป็นเวลา 18-24 ชั่วโมง

4. ทำเช่นเดียวกับข้อ 3 แต่ใช้ TCBS ที่ใส่เกลือแทน

5. ตรวจหาโคโลนีที่ต้องการจากการเพาะเชื้อในข้อ 3. คือ โคโลนีสีเหลืองเนื่องจากการใช้ซูโครส นำไปย้อมสีแกรม V. cholerae มีรูปร่างป็นท่อนโค้ง (curve rod) ย้อมติดสีแกรมลบ

6. ตรวจหาโคโลนีที่ต้องการจากการเพาะเชื้อในข้อ 4. V.parahaemolyticus และ V. vulnificus มีโคโลนีสีเขียว มีรูปร่างป็นท่อนโค้ง (curve rod) ย้อมติดสีแกรมลบ

7. นำเชื้อมาทดสอบ oxidase โดยการหยดน้ำยา tetrametyl-p-phenylene diamine หรือ dimethyl-p-phenylene diamine hydrochloride. ลงบนกระดาษกรอง Whatman No.2 แล้วนำเชื้อมาเต็มห่วง เขี่ยเชื้อละเลงบนหยดน้ำยา ถ้าให้ผลบวกจะเกิดสีม่วงถึงสีดำภายใน 15 วินาที ถ้าให้ผลลบสีจะไม่เปลี่ยนแปลง เชื้อ Vibrio ต้องให้ผลบวก

8. นำเชื้อที่มีลักษณะตามต้องการมาทดสอบสมบัตัทางชีวเคมี โดยการใช้อาหาร TSI และ LIM ตามวิธีที่ได้กล่าวไว้แล้วในบทปฏิบัติการที่ผ่านมา แล้วเปรียบเทียบผลที่ได้ในตาราง