"Rapid Method in Aerobic plate count Food Testing"

พวกเรานักศึกษาในกลุ่มวิจัย การผลิตชาสมุนไพรคุณภาพสูง ได้ฟังการบรรยายจากทีมงาน Sr.Product Speciallist
บริษัท 3 เอ็ม ประเทศไทย จำกัด เรื่อง วิธีการตรวจหาปริมาณจุลินทรีย์ในอาหาร โดยวิธีการตรวจสอบที่รวดเร็วด้วยการใช้
3M PetrifilmTM Plates เพื่อตรวจปริมาณ เชื้อ Aerobic plate count และ Coliform และ E.coli เพื่อใช้ประโยชน์ใน
งานวิจัยของกลุ่ม ซึ่งมีวัตถุประสงค์เพื่อทดสอบผลของการล้างสมุนไพร เช่น อัญชัน ขมิ้น ใบเตย ต่อปริมาณจุลินทรีย์
ดังกล่าว พวกเราจึงได้สรุปมาเพื่อจะได้เป็นประโยชน์กับผู้สนใจค่ะ

ความสำคัญของการตรวจวิเคราะห์จุลินทรีย์ในอาหาร

จุลินทรีย์มีบทบาทความสำคัญในอาหาร พวกเราชาววิศวกรรมอาหารคงจะคุ้นเคยกันเป็นอย่างดี ซึ่งจุลินทรีย์พบได้ทั่วไป
ในสิ่งแวดล้อม ในดิน อากาศ น้ำ ซึ่งมีการปนเปื้อนกับพืชสมุนไพรที่ใช้เป็นวัตถุดิบและก่อให้เกิดปัญหาทำให้ผลิตภัณฑ์
เสื่อมคุณภาพ

นอกจากนี้ ยังได้แบ่งเป็นจุลินทร์ทรีย์บ่งชี้ (indicator microorganisms) ซึ่ง ได้แก่ Coliform, E.coli, Enterobacteriaceae,
Streptococcus feacalis, Yeast และ mold ทั้งนี้เพื่อบ่งชี้ในเรื่องของความเสี่ยงต่อการพบเชื้อก่อโรค มีการปนเปื้อนจาก
เชื้อในทางเดินอาหารหรือจากอุจจาระ ซึ่งสามารถบ่งชี้ถึงสุขอนามัยในการผลิตที่ไม่ดี คุณภาพในการทำความสะอาด บริเวณ
สถานที่ประกอบการ รวมทั้งคุณภาพของวัตถุดิบ และผลิตภัณฑ์อาหารที่อาจยังไม่ดีพอ จึงส่งผลต่อการปนเปื้อนได้ และใน
ส่วนของเชื้อก่อโรค (Pathogens) ได้แก่ Listeria, S.aureus, Salmonella, E.coli (0157), Vibrio, Shigella, Bacillus,
Clostridium, Yersinia เป็นต้น ซึ่งเชื้อก่อโรคเหล่านี้หากร่างกายได้รับเข้าไปจะเป็นอันตรายถึงขั้นร้ายแรงได้

ในเรื่องของการตรวจสอบคุณภาพทางจุลชีววิทยา โดยจะแบ่งเป็นการตรวจเชิงคุณภาพ (3M TecraTM VIA) ที่ใช้ในการ
ตรวจหาว่ามีหรือไม่มีเชื้อนั้นๆ ปนเปื้อนอยู่ในอาหาร ซึ่งมักใช้ตรวจหาเชื้อก่อโรค และในส่วนของการตรวจเชิงปริมาณ
(3M PetrifilmTM Plate) จะเป็นการตรวจหาจำนวนเชื้อที่ปนเปื้อนอยู่ในอาหาร ที่มักใช้ตรวจหาเชื้อดัชนีคุณภาพอาหาร
โดยจะมีการรายงานผลของเชื้อเป็นจำนวนที่นับได้ทั้งหมด มีหน่วยเป็น CFU/ml หรือ CFU/g ......หรือกล่าวง่ายๆ ว่า
เชิงคุณภาพ จะบอกว่ามีหรือไม่มี เชื้อนั้นอยู่ แต่ถ้าเป็นเชิงปริมาณแล้วล่ะก็ต้องเน้นๆ แบบว่าให้เห็นตัวเลขกันชัดๆ ไปเลยว่า
ที่มีน่ะมีเท่าไร โดยชนิดของแผ่นเพาะเลี้ยงเชื้อ 3M PetrifilmTM นั้นก็มีหลายชนิด ได้แก่ Aerobic Count Plate /
Yeast & Mold Count Plate / Coliform Count Plate / Rapid Coliform Count Plate / High Sensitivity Coliform
Count Plate / E.coli/Coliform Count Plate / Enterobacteriaceae Count Plate / Staph Express Count Plate /
Environmental Listeria Count Plate

ทำไมต้องตรวจสอบคุณภาพทางจุลชีววิทยา

การตรวจสอบทุกสิ่งทุกอย่างก็เพื่อความปลอดภัยในทุกๆ ด้าน นั่นแหละค่ะ สิ่งสำคัญของการตรวจสอบคุณภาพทาง
จุลชีววิทยา พวกพี่ ๆ 3M เขาบอกว่าเพื่อให้แน่ใจว่าผลิตภัณฑ์มีความปลอดภัย และสามารถเก็บรักษาได้ในสภาวะและ
ช่วงเวลาที่กำหนด (shelf-life) รวมถึงเพื่อให้แน่ใจว่าวัตถุดิบ ส่วนประกอบในอาหาร และผลิตภัณฑ์สุดท้ายนั้น มีจำนวน
จุลินทรีย์อยู่ในช่วงที่กำหนด (microbiological criteria) และเพื่อทวนสอบ (verification) และรับรอง (validation) แนว
ปฏิบัติและวิธีการที่ใช้ในการควบคุมกระบวนการผลิตในขั้นตอนต่างๆ ว่ายังอยู่ภายใต้การควบคุมตามข้อกำหนดนั้นๆ
โดยเฉพาะในการทวนสอบ รับรอง เฝ้าระวังและการควบคุมจุดวิกฤติ รวมถึงวิธีการแก้ไขด้วยเช่นเดียวกัน

ประวัติความเป็นมา

เจ้าแผ่นนี่ก็ได้ถูกคิดค้นขึ้นโดยนักวิทยาศาสตร์ที่ได้บังเอิญเห็นตัวเทปกาวชนิดใสแล้วก็เกิดเป็นไอเดียในการต่อยอด
พัฒนาเป็นแผ่นตรวจเชื้อ 3M PetrifilmTM Plates นี่แหละค่ะ

ส่วนประกอบและคุณลักษณะ

เอาล่ะค่ะเรามาทราบกันดีกว่าว่า 3M PetrifilmTM Plates เนี่ยมันคืออะไรกันนะ พี่ 3M เขาบอกว่า Petrifilm เป็นอาหาร
เลี้ยงเชื้อสำเร็จรูป โดยมีลักษณะเป็นผงแห้งที่เคลือบอยู่บนแผ่นฟิล์มพลาสติก สำหรับใช้วิเคราะห์หาจำนวนของเชื้อ
แบคที่เรียและเชื้อยีสต์รา ในส่วนของส่วนประกอบหลักๆ ของ 3M PetrifilmTM จะประกอบด้วยแผ่นพลาสติกสองแผ่นที่
ประกบกันอยู่ โดยแผ่นบนเป็นแผ่นฟิล์มพลาสติกใสที่แบ่งย่อยออกเป็นอีกสามชั้นที่เคลือบอยู่ ดังนี้ ชั้นบนสุดเป็นแผ่นฟิล์ม
พลาสติก รองลงมา จะเป็นชั้นของ กาว+สารบ่งชี้ และชั้นล่างจะเป็นเจลละลายในน้ำเย็น ในส่วนของแผ่นล่างนั้นจะประกอบ
ด้วยชั้นย่อยๆ อีกสามชั้นเช่นกัน ชั้นบนสุดเป็นชั้นของอาหารเลี้ยงเชื้อ (Agar) รองลงมาเป็นชั้นของกาว และชั้นล่างสุดของ
แผ่นล่างจะเป็นแผ่นพลาสติกพิมพ์ลาย ....เห็นแผ่นบางแค่นี้เองแต่ส่วนประกอบนี่เยอะมากเลยที่เดียว (ดูภาพอธิบายด้านล่างนะคะ)

3M PetrifilmTM Aerobic Count Plate (PAC) โดยส่วนประกอบของแผ่นตรวจนั้นตัวสารบ่งชี้ที่ใช้ในแผ่นตรวจชนิดนี้จะ
เป็น สีไตรเฟนนิล เตทตระโซเลียม คลอไรด์ (Triphenyl Tetrazolium Chloride-TTC) และในส่วนของอาหารเลี้ยงเชื้อนั้น
จะเป็น Plate Count Agar ที่แบคทีเรียทั่วไปสามารถเจริญเติบโตได้ดี โดยมีสารที่ทำให้อาหารเลี้ยงเชื้อแข็งตัวคือ เจลที่
ละลายในน้ำเย็น มาดูกันต่อในส่วนของวิธีการใช้แผ่น PAC ซึ่งวิธีการวิเคราะห์นี้เป็นวิธีที่ได้รับการรับรองจากหน่วยงาน
มาตรฐาน AOAC เป็นที่เรียบร้อยแล้ว เริ่มจากทำการหยดตัวอย่างปริมาตร 1 ml ลงบนแผ่นตรวจเชื้อ จากนั้นนำไปบ่มเชื้อ
ที่อุณหภูมิ 35 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 48 ชั่วโมง โดยการวางแผ่นตรวจในเครื่องบ่มเชื้อนั้นสามารถวางซ้อนกันได้ไม่เกิน
20 แผ่น และนำมาอ่านผลเมื่อครบเวลา

ในการอ่านผล aerobic bacteria จะทำการนับโคโลนีที่มีสีแดงทั้งหมดที่อยู่ในพื้นที่วงกลม 20 ตารางเชนติเมตร ซึ่งช่วงที่
เหมาะสมในการนับโคโลนีจะอยู่ในช่วง 30-300 โคโลนีต่อแผ่น

ข้อแตกต่างจากวิธีการทดสอบแบบดั้งเดิม

เอ๊...แล้ว 3M PetrifilmTM เนี่ย แตกต่างกับวิธีทดสอบแบบดั้งเดิม และทำให้ทดสอบได้ง่ายขึ้นยังไงกันนะ เรามาดูกันในส่วน
ของวิธีการแบบดั้งเดิมกันก่อนเลยค่ะ โดยวิธีการแบบดั้งเดิมนั้นต้องมีการเตรียมอาหารเลี้ยงเชื้อกันอย่างมากมายหลายขั้นตอน
เริ่มจากการชั่ง จากนั้นนำไปผสมน้ำ วัดค่า pH ทำ autoclave ที่ความดัน 15 ปอนด์ จากนั้นก็ต้องมีการอบฆ่าเชื้อที่อุปกรณ์
ด้วย hot air อุณหภูมิ 180 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 2-3 ชั่วโมง จานเพาะเลี้ยงเชื้อหรืออุปกรณ์ต่างๆ จะต้องมีการมาล้าง
ทำความสะอาด เมื่อทดลองมากๆ อุปกรณ์เหล่านี้จะต้องมากเช่นเดียวกัน ทั้งเสียเวลาและเปลืองพื้นที่ในการเก็บ เห็นมั๊ยล่ะคะ
ว่าขั้นตอนเยอะมากๆ

แล้วแผ่น 3M PetrifilmTM นี้ล่ะมันดียังไงกัน พวกพี่ ๆ 3M ได้บอกว่า 3M PetrifilmTM Plates เนี่ยจะช่วยเพิ่มประสิทธิภาพ
ในการทำงาน ทำให้ได้ผลการตรวจสอบที่มีความแม่นยำ เป็นวิธีการที่รวดเร็ว ซึ่งจะส่งผลต่อการลดค่าใช้จ่ายโดยรวมได้ด้วย
ประหยัดทั้งเงิน ประหยัดทั้งเวลา....แหม มันน่าใช้ซะจริงเชียว !!!

มาตรฐานของการตรวจสอบ

มาถึงในส่วนของวิธีมาตรฐาน (Standard Method) ได้มีการบอกถึงมาตรฐานต่างที่เราสามารถใช้อ้างอิงได้ในการตรวจสอบ
ได้แก่ International Standards : ISO National Standards : TIS, BS, DIN, EPA, BAM Internationally recognized
organizations : AOAC, ICUMSA, IOB, IP, ICMSF Nationally recognized organizations : EPA, USFDA, BAM,
APHA ว้าว...เยอะแยะมากมายหลายหน่วยงาน แต่ที่พวกพี่ๆ ได้นำมาเสนอก็จะเป็นหน่วยงานของ AOAC ซึ่ง AOAC
= Association of Official Agricultural Chemist เป็นหน่วยงานพิสูจน์ความถูกต้องของวิธีทดสอบ โดยก่อตั้งขึ้นที่ประเทศ
สหรัฐอเมริกา แต่ได้เป็นที่ยอมรับทั่วโลก ทั้งอเมริกา แถบยุโรป และเอเชีย เลยทีเดียว การพิสูจน์ความถูกต้องของวิธีทดสอบ
(Validation) โดยมีกระบวนการตรวจสอบเพื่อพิสูจน์ว่าวิธีทดสอบมีความถูกต้อง น่าเชื่อถือ และเหมาะสมกับวัตถุประสงค์
ได้แก่ ให้เป็นไปตามข้อกำหนดของประเทศหรือระหว่างประเทศ (regulation) การควบคุณคุณภาพสินค้านำเข้าและส่งออก
(import/export control) การขอรับรองคุณภาพห้องปฏิบัติการ (in accredited laboratories) เป็นต้น

ขั้นตอนการทดสอบ

การทดสอบปริมาณจุลินทรีย์ในอาหาร

• การเตรียมตัวอย่าง

ขั้นตอนของการทดสอบ พี่ๆ ก็ได้บอกให้พวกเราได้ตั้งใจฟังกันให้ดี เริ่มจากในส่วนของการเจือจางตัวอย่างอาหาร สามารถ
ทำได้โดย ขั้นแรกชั่งตัวอย่างอาหารหนัก 50 กรัม ใส่ถุงพลาสติก จากนั้นเติมบัพเฟอร์ ปราศจากเชื้อ (Buffered Peptone
Water, Butterfield's phosphate- Buffered) 450 ml ลงไป นำไปตีบดโดยใช้ Stomacher หรือ Blender เป็นเวลา 2 นาที
จะได้ตัวอย่างอาหารที่เจือจางในอัตราส่วน 1:10

เอ๊...แล้วเชื้อในผลิตภัณฑ์มีการกระจายตัวแบบไหน คำตอบคือการกระจายตัวของจุลินทรีย์ดังภาพ B โดยเชื้อมักจะกระจาย
เป็นกลุ่มก้อน ส่วนในภาพ A นั้นจะเป็นการกระจายตัวของสาร

• การเจือจางตัวอย่าง

มาต่อกันในเรื่องของการเจือจางตัวอย่างอาหาร โดยวิธีการคือ จะดูดตัวอย่างที่ความเจือจาง 1:10 ปริมาตร 1 ml ผสมกับ
บัพเฟอร์ 9 ml จะได้ตัวอย่างที่มีความเจือจาง 1:100 เรียกว่า Ten-fold dilution แล้วเราจะทำการเจือจางต่อไปจนกว่าจะถึง
ความเข้มข้นที่ต้องการ การเจือจางตัวอย่างนั้นเราทำเพื่อลดความหนาแน่นของจุลินทรีย์ให้อยู่ในระดับที่ให้ผลการวิเคราะห์
ที่เชื่อถือได้ โดยทั่วไปมักทำให้ตัวอย่างเจือจางลงครั้งละ 10 เท่า

• ดูด หยด บีบ บ่ม

ค่ะในส่วนของขั้นตอนต่อไปนี้เราจะมาดูวิธีการสาธิตการทดสอบการใช้แผ่นเพาะเลี้ยงเชื้อ 3M PetrifilmTM อย่างมีประสิทธิ
ภาพกันนะคะ โดยจะเริ่มจากวางแผ่น Petrifilm บนระนาบเรียบ หยดตัวอย่าง 1 ml ลงบนแผ่นอาหารเลี้ยงเชื้อด้านล่าง
จากนั้นค่อยๆ ปล่อยแผ่นฟิล์มด้านบนลงมา ขั้นตอนนี้ต้องระวังอย่าให้เกิดฟองอากาศ วางตัวกดพลาสติก (spreader) บน
แผ่นฟิล์มด้านบนแล้วออกแรงกด รอให้เจลแข็งตัวประมาณ 1 นาที ก่อนทำการเคลื่อนย้ายแผ่น จากนั้นนำแผ่นไปบ่มที่
อุณหภูมิ และระยะเวลาตามที่กำหนด

การทดสอบปริมาณจุลินทรีย์ในอากาศ

ในส่วนของการทดสอบสิ่งแวดล้อมมาดูการตรวจอากาศ (air test) กันก่อนเลยค่ะ ขั้นแรกหยดบัพเฟอร์ที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้ว
ปริมาตร 1 ml ลงบนแผ่น Petrifilm แล้ววางทิ้งไว้ที่อุณหภูมิห้อง 1 ชั่วโมง เปิดแผ่นฟิล์มด้านบนทิ้งไว้บริเวณที่ต้องการทดสอบ
เป็นเวลา 15 นาที จากนั้นนำไปบ่มตามอุณหภูมิและระยะเวลาตามแต่ชนิดของ Petrifilm โดยสามารถเก็บแผ่นที่เตรียมแล้วได้
นานถึง 7 วัน

ส่วนการทดสอบพื้นผิวโดยตรง (direct contact) สามารถทำได้โดยหยดบัพเฟอร์ที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้วปริมาตร 1 ml ลง
บนแผ่น Petrifilm ปล่อยวางไว้ที่อุณหภูมิห้อง 1 ชั่วโมง เปิดแผ่นฟิล์มด้านบน จากนั้นนำแผ่นฟิล์มด้านบนไปแปะลงบนพื้น
ผิวที่ต้องการทดสอบ แล้วใช้นิ้วลูบบนแผ่นฟิล์มด้านหลังเบาๆ เพื่อให้เนื้อเจลสัมผัสกับพื้นผิวอย่างทั่วถึง ทำการปิดแผ่น
ฟิล์มด้านบนลง ให้ประกบกันดังเดิม จากนั้นนำไปบ่มตามอุณหภูมิและระยะเวลา ตามแต่ชนิดของ Petrifilm ค่ะ

การตรวจนับและรายงานผล

3M PetrifilmTM Aerobic Count Plate (PAC) พื้นที่วงกลม 20 ตารางเชนติเมตร โดยสเกล 1 ช่องนั้นจะเท่ากับ 1 ตาราง
เซนติเมตร เราสามารถที่จะใช้การอ่านข้อมูลแบบประมาณได้หากว่าเชื่อที่เกิดขึ้นนั้นมีปริมาณมาก โดยการนับจำนวนจุลินทรีย์
ในช่องที่มีการกระจายตัวของเชื้อดีที่สุด จากนั้นก็นำค่าที่นับได้ใน 1 ช่องคูณกับ 20 ก็จะได้ค่าประมาณของเชื้อทั้งหมดค่ะ

สุดท้ายนี้พวกเราขอขอบคุณพี่ๆ 3M นะคะที่มาให้ความรู้ใหม่ๆ ในเรื่องของการตรวจเชื้อ ขอบคุณอาจารย์ที่คอยเสริมเพิ่ม
เติมความรู้ต่างๆ ที่นอกเหนือจากนี้ และขอบคุณเพื่อนๆ โปรเจคทุกๆ คนที่ต่างก็ตั้งใจฟังกันเป็นอย่างดี ขอบคุณมากค่ะ