การศึกษาเชื้อราและยีสต์ที่ทำให้อาหารเสีย (Microscopic observation of foodborne fungi)

อุปกรณ์

1. ตัวอย่างอาหารชนิดต่างๆ ได้แก่ เมล็ดถั่ว เมล็ดธัญชาติชนิดต่างๆ ผลไม้แห้ง ผลไม้แช่อิ่ม น้ำผลไม้

และอาหารที่มีการเจริญของเชื้อรา

2. เชื้อราที่ทำให้อาหารเสีย ได้แก่ Rhizopus stolonifer, Aspergillus flavus, Aspergillus ochraceus, Fusarium moniliforme

3. ยีสต์ที่ทำให้อาหารเสีย ได้แก่ Candida lipolytica, Hanseniaspora uvarum, Rhodotorula glutinis,Pichia membranaefaciens,
Schizosaccharomyces pombe และ Zygosaccharomyces rouxii

 

4. อาหารเลี้ยงเชื้อที่ใช้ได้แก่

- Plate Count Agar (PCA) ที่เติมคลอแรมฟินิคอล 100 มิลลิกรัมต่อลิตร ใช้เลี้ยงเชื้อราทั่วไป

- Malt Extract Agar (MEA) (pH ประมาณ 5.0) เหมาะสำหรับเพาะเลี้ยงยีสต์จากอาหารที่มีเชื้อราน้อย

กว่ายีสต์ เช่น น้ำผลไม้ และโยเกิร์ต แต่ถ้าตัวอย่างอาหารมีเชื้อราอยู่มาก เช่น เนยแข็ง ควรใช้ DRBC

 

หมายเหตุ การเดิมสารปฏิชีวนะและสารละลายกรดลงในอาหารเลี้ยงเชื้อ มีจุดประสงค์เพื่อยับยั้งการ

เจริญของแบคทีเรีย คลอแรมฟินิคอลไม่ถูกทำลายด้วยความร้อนในขณะฆ่าเชื้อ การเตรียมสารละลาย

(stock solution) ของคลอแรมฟินิคอล ทำได้โดยชั่งคลอแรมฟินิคอล 0.1 กรัม ใส่ในน้ำกลั่น 40 มิลลิลิตร

และเติมสารละลายนี้ (40 มิลลิลิตร) ลงในอาหารเลี้ยงเชื้อทั้งหมด 960 มิลลิลิตรก่อนนำไปฆ่าเชื้อ

(บรรจุ stock solotion ไว้ในขวดสีชา เก็บไว้ได้ 1 เดือนในตู้เย็น)

5. จานเพาะเชื้อ หลอดทดลอง ปิเปตขนาด 1 มิลลิลิตร ปากคีบ และแท่งแก้วงอ

6. แผ่นสไลด์ (glass slide) กระจกปิดสไลด์ (coverslip) และแท่งแก้วรูปตัววี (V-shaped glass

rod)

7. ห่วงเขี่ยเชื้อ (loop) เข็มเขี่ยเชื้อ (needle) และปาสเตอร์ปิเปตต์ที่ปราศจากเชื้อ (steriled Pasteur

pipette)

8. กล้องจุลทรรศน์พื้นหลังสว่าง (bright-field microscope) และกล้องสเตอริโอ (stereomicroscope)

 

วิธีการทดลอง

ก) การเตรียมและสังเกตลักษณะโคโลนีของเชื้อราและยีสต์

1. ทำการถ่ายเชื้อราบริสุทธิ์แต่ละชนิดลงบนผิวหน้าอาหาร PDA (1 species ต่อจาน) โดยใช้ห่วงเขี่ยเชื้อ

เผาจนร้อนแดง เพื่อทำให้ปราศจากเชื้อ จากนั้นถ่ายเชื้อราจากหลอดทดลอง แตะลงบนผิวหน้า

อาหาร PCA ในจานเพาะเชื้อ 3 จุด ห่างประมาณ 1 นิ้ว สำหรับเชื้อยีสต์ ให้ใช้ลูปเขี่ยเชื้อเผาไฟจนร้อนแดง

จากนั้น แตะเชื้อยีสต์มาลากบนผิวหน้าอาหาร MEA แบบ Simple streak นำไปบ่มที่อุณหภูมิ 25 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 7 วัน

 

2. หลังจากที่โคโลนีขึ้นแล้ว สังเกตปรากฏการณ์ (macroscopic appearance) บันทึกสี ลักษณะของโคโลนีและเส้นใย

วัดขนาดเส้นผ่านศูนย์กลางของโคโลนี ตรวจดูเส้นใยและโคนิเดียด้วย

กล้องจุลทรรศน์สเตอริโอวาดรูปโครงสร้างของเชื้อราบริสุทธิ์แต่ละชนิด

 

ข) เทคนิคการเตรียม slide culture ของเชื้อราและยีสต์

1. หลอมอาหาร PCA และอาหาร MEA ที่บรรจุใส่หลอดทดลอง ทำให้เย็นจนถึงอุณภูมิ 45 องศาเซลเซียส

2. ทำความสะอาดแผ่นสไลด์ ล้างให้สะอาด เช็ดให้แห้ง ใช้ปากคีบหนีบแผ่นสไลด์จุ่มในแอลกอฮอล์

ความเข้มข้นร้อยละ 95 ลนผ่านเปลวไฟเพื่อฆ่าเชื้อ ทิ้งไว้ให้เย็น วางแผ่นสไลด์ที่ฆ่าเชื้อแล้วบนแท่ง

แก้วรูปตัววีในจานเพาะเชื้อที่ฆ่าเชื้อแล้ว ซึ่งมีกระดาษทิชชูรองอยู่ที่ก้นจาน

3. ใช้ปาสเตอร์ปิเปตต์ที่ปราศจากเชื้อดูดอาหาร PCA (สำหรับเชื้อรา) และอาหาร MEA (สำหรับยีสต์)

วางลงบนแผ่นสไลด์ ทิ้งไว้ให้แข็งตัว

4. นำเข็มเขี่ยเชื้อมาเผาไฟจนร้อนแดง แล้วเขี่ยเชื้อรา แตะลงบนผิวหน้าอาหาร PCA บนแผ่นสไลด์

กรณีเชื้อยีสต์ ใช้เข็มเขี่ยเชื้อแตะเชื้อยีสต์มาลากบนผิวหน้าอาหารด้วยกระจก ปิดสไลด์ที่ปราศจากเชื้อ

(จุ่มแอลกอฮอล์แล้วลนผ่านเปลวไฟ)

5. เทน้ำกลั่นลงบนกระดาษทิชชูที่วางไว้ในจานเพาะเชื้อ นำไปบ่มที่อุณหภูมิ 25 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 7 วัน

ตรวจดูการสร้างไมซีเลียมและซูไมซีเลียมด้วยกล้องจุลทรรศน์ กำลังขยาย 10 เท่า และ 40 เท่า

วาดรูปเส้นใยของเชื้อราและโครงสร้างอื่นๆ ที่มองเห็น